RNAの抽出の準備および注意

ピペットの先端の殺菌およびEPの管、等。

1. 脱イオンされた水との0.1% （1第1000） DEPC （非常に有毒物質）を準備し、発煙のフードで注意深く使用し、そしてライトからの4°Cで貯えなさい;

DEPC水はDEPCと扱われ、高温および高圧によって殺菌する純粋な水である。RNase、DNaseおよびプロティナーゼがないためにテストされる。

2. ピペットの先端およびEPの管を0.1% DEPCに入れ、ピペットの先端およびEPの管が0.1% DEPで満ちていることを確認しなさい。

3. 軽いから保護しなさい、立場を、夜通し許可しなさい（12-24h）

4. 先端およびEPの管を含んでいる箱はDEPCで浸る必要はない。大体先端またはEPの管のDEPC水を取除いた後、それを詰め、包みなさい。

5. 121の摂氏温度、30min

6. 180の摂氏温度は数時間（少なくとも3時間）の間、乾燥する

注:a. DEPCを扱う場合の摩耗の乳液の手袋およびマスク!DEPCの殺菌のないb、または、130 ℃、90minオートクレーブ（二度多くの実験室の高温殺菌）

RNAの抽出の考察

ティッシュのRNAの分離の失敗の2つの主要な現象

RNAが培養された細胞から容易に低下しないなぜ得たかティッシュの不純物のRNAの低下そして残余は、低下に関して、私達が見ることを最初に可能にした。あるRNAの抽出の試薬はすべて急速にRNaseを禁じる部品を含んでいる。lysateを培養された細胞に単に加え、混合しなさい、すべての細胞はlysateと完全に混合することができ細胞は完全に分離する。細胞が分離した後、lysateの有効成分はすぐに細胞内のRNaseを禁じる、従ってRNAはそのまま残る。すなわち、培養された細胞がlysateと容易そして十分に連絡されるので、RNAは容易に低下しない;一方では、ティッシュのRNAは容易にティッシュの細胞がすぐにlysateに連絡して容易ではないので低下する。十分な接触が原因で。従って、そこに仮定は禁止のRNAの活動が、低下の問題完全に解決できる間、単一セルにティッシュを回す方法である。

液体窒素の製粉は最も有効そのような方法である。但し、液体窒素製粉方法は特にサンプルの数が大きいとき、非常に面倒である。これは次の最もよい事をもたらした:ホモジェナイザー。ホモジェナイザー方法は細胞がlysateと連絡されるが禁じられたり、むしろティッシュの中断の率は細胞内のRNaseがRNを低下させる率より速いことが祈るか前にRNaseの活動によってがいかにの質問を考慮しない。

電気ホモジェナイザーの効果はよりよく、ガラス ホモジェナイザーの効果は粗末である、しかし一般に、ホモジェナイザー方法は低下現象を防ぐことができない。従って、抽出が低下すれば、元の電気ホモジェナイザーは液体窒素との粉砕に使用するべきである;元のガラス ホモジェナイザーは電気ホモジェナイザーに変わるか、または液体窒素と直接製粉されるべきである。問題は実行可能なほぼ100%である。解決する得なさい。

それに続く実験に影響を与える不純物の残余問題に低下より多様な原因があり、解決は相応じて異なっている。ティッシュに低下または残りの不純物があれば結論として、特定の実験材料のための抽出の方法/試薬は最大限に活用されなければならない。最適化のためにあなたの貴重なサンプルを使用する必要がない:および蛋白質の抽出-口、胃および腸のエキスとの粉砕のための他の部品を取るために市場からの魚/鶏のような少しだけ小さい動物を、RNAの抽出のための材料の対応する一部分買う、ことができる。

得られたRNAのターゲットRNAは別のために追う実験を使用され、品質要求事項は異なっている

cDNAの図書館の構造は酵素反応の抑制剤の残余なしでRNAの完全性を要求する;北より高いRNAの完全性を要求し、酵素反応の抑制剤の残余のための条件を下げる;RT-PCRは余りに高いRNAの完全性を要求しないが、酵素反応を禁じる。残余の条件は厳密である。入力は出力を定める;目的は高い純度のRNAを得ることである度に人々およびお金を要する。

サンプルのコレクション/貯蔵

サンプルが生きているbody/orに元の成長の環境を去った後低下に影響を与える要因は、サンプルの内生酵素RNAを低下させ始め低下率は内生酵素および温度の内容と関連している。従来、完全に内生酵素活性を禁じるたった2つの方法がある:lysateをすぐに加え、完全そして急速に均質にしなさい;小さい部分に液体窒素ですぐに凍るために割り込めば。アプローチは両方とも速い操作を要求する。後者は前はより均質になりが細胞および内生酵素の低い内容が付いているティッシュのためだけに適し、易いが、すべてのサンプルのために適している。具体的には、植物ティッシュ、レバー、胸腺、膵臓、脾臓、頭脳、脂肪、筋肉ティッシュ、等最もよく進行の前の液体窒素と凍らせている。

サンプルの分裂そして均質化

低下および収穫のサンプル分裂に影響を与える要因はRNAの完全で、完全な解放のためである完全な均質化のためである。細胞は壊れないで直接均質にすることができる。ティッシュは破損の後やっと均質にすることができる。均質にすることができる前にイーストおよび細菌は対応する酵素と壊れる必要がある。より低い内生酵素の内容およびより容易な均質化を用いるティッシュはホモジェナイザーによってlysateで同時に押しつぶされ、均質にすることができる;植物ティッシュ、レバー、胸腺、膵臓、脾臓、頭脳、脂肪、筋肉ティッシュおよび他のサンプル、彼らは内生酵素で高かったりまたは容易に均質にならない、従ってティッシュの中断および均質化は別に行われなければならない。分裂の最も信頼でき、最も生産的な方法は液体窒素と製粉して、均質化の確かな方法は電気ホモジェナイザーの使用である。液体窒素との製粉についての特別な注記:サンプルは全体の製粉プロセスの間に凍らせていたとき内生酵素が作用するためにが本当らしいので分かれてはならない。

lysateの選択

操作の便利および残りの内生不純物の要因に影響を与えて一般的な換散の解決はほとんどRNaseの活動を禁じることができる。従って、換散の解決の選択の急所は浄化方法を伴って考慮することである。1つの例外がある:高い内生酵素の内容が付いているサンプルは内生酵素を不活性にする機能を高めるためにフェノールを含んでいるlysateを使用するために推薦される。

浄化方法の選択

残りの内生不純物に影響を与える要因、細胞のようなきれいなサンプルのための抽出の速度は手もとほとんどあらゆる浄化方法と、満足な結果得ることができる。しかし他の多くのサンプル、植物、レバー、細菌、等のような不純物のハイ レベルとの特にサンプルのため、適した浄化方法を選ぶことは重大である。コラムの遠心浄化方法に速い抽出の速度があり、効果的にRNAのそれに続く酵素の反作用に影響を与えるが、高い不純物を取除くことができる（Foregeneはより多くの細部ここにかちりと鳴る費用効果が大きいキットを提供できる）;経済的で、古典的な浄化方法を、LiClの沈殿物のような使用することはまた、満足な結果を得ることができるが操作の時間は長い。

RNAの抽出のための「3つの訓練そして8つの注意」

訓練1:外因性の酵素の汚染に端を置きなさい。

ノート1:厳しく摩耗のマスクおよび手袋。

ノート2:実験にかかわる遠心分離機管、先端の頭部、ピペットの棒、電気泳動タンクおよび実験ベンチは完全に捨られるべきである。

ノート3:実験に、特に水はかかわる、試薬/解決RNaseなしでなければならない。

訓練2:内生酵素の活動を妨げなさい

ノート4:適切な均質化方法を選びなさい。

ノート5:適切なlysateを選びなさい。

ノート6:サンプルの開始量を制御しなさい。

訓練3:あなたの抽出の目的を明白にしなさい

ノート7:サンプルの最高の開始量に近づいていてあらゆるlysateシステムが抽出の成功率ははっきりと落ちる。

ノート8:巧妙なRNAの抽出のための唯一の経済的な規準はそれに続く実験の成功、ない収穫である。

RNaseの汚染の上の10のもと

1. 指は外因性の酵素の最初の源である、従って手袋は頻繁に身に着けられ、取り替えられなければならない。さらに、マスクはまた呼吸がまた酵素の重要な源であるので身に着けられていなければならない。手袋のマスクを身に着けていることの付加的な利益は実験者を保護することである。

2. 印が付いていてもピペットの先端、遠心分離機管は、ピペットで移す– RNaseは単独で殺菌によって不活性にすることができない従ってDEPCが扱ったようにピペットの先端および遠心分離機管はDEPCと扱われるべきである。使用の前に75%アルコール綿球、特に棒と特定目的のピペットを使用することが最善拭くそれをである;さらに、ヘッド除去剤を使用しないこと確実であるため。

3. 水/緩衝はRNaseの汚染の自由でなければならない。

4. 少なくともテスト テーブルは75%アルコール綿球ときれい拭かれるべきである。

• すべてのティッシュが液体窒素が付いているティッシュの内生急速冷凍酵素、そう急速冷凍をを含んでいる内生RNaseは低下を減らす最もよい方法である。液体窒素の貯蔵/粉砕方法は全く不便であるが、それは内生酵素のハイ レベルが付いているティッシュのための唯一の方法である。

6. RNAはRNAの抽出プロダクトをRNaseの汚染の跡を含むかもしれない見本抽出する。

7. プラスミッドの抽出のプラスミッドの抽出は頻繁にRNAを低下させるのにRnaseを使用し残りのRnaseはプロティナーゼKと消化され、PCIによって得られるべきである。

8. 低温で貯えられてもRNAの貯蔵により、RNaseの微量RNAの低下を引き起こす。RNAの長期保存のための最もよい解決はアルコールが低温ですべての酵素の活動を禁じるので、塩/アルコール懸濁液である。

9. 陽イオン（カリフォルニア、Mg）がこれらのイオンを含んでいる場合、5分の80Cで熱することはRNAを裂く従ってRNAが熱される必要があれば保存の解決はキレート環を作る代理人（1mMナトリウム クエン酸塩、pH 6.4）を含む必要がある。

10. それに続く実験で使用される酵素はRNaseによって汚染されるかもしれない。

RNAの抽出のための10のヒント

1:すぐにRNaseの活動を防ぐため。サンプルはコレクションの後ですぐに凍り、RNaseは換散の間に急速な操作によって不活性になる。

2:高いribozymeの内容が付いているティッシュのための適切な抽出方法を選べば、脂肪組織はフェノールを含んでいる方法を使用してよい。

3:予言の質は北を要求する、cDNAの図書館の構造は高品質を要求し、RT-PCRおよびRPA （リボヌクレアーゼの保護試金）は高品質を要求しない。RT-PCRは高い純度（酵素阻害剤の残余）を要求する。

4:完全な均質化は収穫を改良し、低下を減らすことへキーである。

5:RNAの電気泳動の検出、28Sの完全性を点検しなさい:18S = 2: 1つは完全な印、1である: 1つはほとんどの実験のためにまた受諾可能である。

6:RT-PCRのためのDNAの取り外し、配列の分析DNAを取除くのにDnase Iを使用することが最善である。

7:外因性の酵素の汚染を減らしなさい-酵素は外側から輸入することができない。

8:低集中の核酸を集中した場合、共同沈殿物の試薬は加えられるべきである。しかし酵素およびDNAの汚染を含んでいる共同沈殿剤を防ぐため。

9:完全に5分の65CでRNAを、熱必要ならば分解しなさい。

適した貯蔵方法

それは–少しの間20C、およびの–長い間80Cで貯えることができる。RNAの収穫の改良の第一歩は異なったサンプルのRNAの内容が非常に変わることを意識することである。レバー、膵臓、中心、頭脳、胚、腎臓、肺、胸腺、卵巣、低い豊富のような中型の豊富（0.05-2ug/mg）のような高い豊富（2-4ug/mg） （<0>

1:RN解放するために細胞を分離させなさい– RNAが解放されなかったら、収穫は減る。他の均質化方法よりよい電気均質化の仕事はまたしかし潰す液体窒素のような他の方法と、結合される必要がある場合もある酵素の消化力（リゾチーム/Lyticase）

2:抽出方法の最適化。フェノール ベースの方法の最も大きい問題は不完全な成層および部分的なRNAの損失（上澄みは完全に取除くことができない）である。不完全な成層は使用されるlysateの量を高めるか、またはサンプルの量を減らすことによって解決することができる高い核酸および蛋白質内容が原因である。クロロホルム抽出のステップは脂肪組織に加えられた。RNAの損失はバック ポンプまたは遠心分離に先行している有機性層を取除くことによって減らすことができる。コラムの遠心分離ベースの方法の最も大きい問題は余分なサンプルである。

古典的な抽出の先端

1. フェノールの浄化:1-2分の間1:1のフェノール/クロロホルムおよび組合せの等しい容積を活発に加えなさい。2分の間高速で遠心分離機にかけなさい。注意深く上澄み（80-90%）を取除きなさい。決して中間の層に得てはいけない。反作用の解決の等しい容積はフェノール/クロロホルムに加えることができ、上澄みは取除いた。2つのsupernatantsは核酸の沈殿物が収穫を改良することができるように一緒に混合することができる。混合した場合余りにも穏やかでし、すべての上澄みを取除くには試みてはいけない。

2. 70-80%エタノールとの洗浄:洗浄の間に残りの塩が洗い流されることを保障するために、核酸は中断されなければならない。同時に次に、遠心分離機はピペットによってエタノールを離れて高速で注ぐ直後に数秒間、そして残りのエタノールを取除く。5-10分の室温で立つことの後で分解しなさい。

11. 特別な組織の抽出

1. 繊維状ティッシュ:中心/骨格筋のような繊維状ティッシュからのRNAの抽出へのキーは完全にティッシュを破壊することである。これらのティッシュに低い細胞密度がある、従ってティッシュの単位重量ごとのRNAの量は低く、可能ように多くの開始量として使用することが最善である。凍結の条件の下でティッシュを完全にひくことを忘れないでいなさい。

2. 高蛋白/脂肪分が付いているティッシュ:頭脳/植物性脂肪の内容は高い。PCIの抽出の後で、上澄みは白いflocculesを含んでいる。上澄みはクロロホルムと再抽出されなければならない。

3. 高い核酸/ribozymeの内容が付いているティッシュ:脾臓に/胸腺は高い核酸およびribozymeの内容がある。急速な均質化に先行している凍結の条件の下の粉砕のティッシュは効果的にribozymesを不活性にすることができる。但し、lysateが余りにも粘性（高い核酸の内容が原因で）なら、PCIの抽出は効果的に成層化できないには;より多くのlysateを加えることはこの問題を解決できる。多数PCIの抽出は残りDNAを取除くことができる。DNAの汚染を示せばアルコール、それを加える直後の白い沈殿物の形態が。分解がDNAの汚染を取除くことができた後酸性PCIとのRe-extraction。

4. 植物ティッシュ:植物ティッシュは動物組織より複雑である。通常、植物は液体窒素の状態、そう内生酵素によるRNAの低下の下で珍しいひかれる。低下問題が解決されなければ、サンプルに含まれている不純物によってほとんど確かに引き起こされる。不純物は残余に多くの植物で導く含み、これらの不純物にRNAとのある類似があるので残余の理由は頻繁にある:沈殿し、私は沈殿し、吸着し、私は吸着する。これらの特徴は非常に強い酵素阻害剤であることを定める。

現在、商業RNAの抽出の試薬は小さい調節を用いるほとんどすべての動物組織に合わせることができるがほとんどの植物ティッシュのために適する少数の商業RNAの抽出の試薬がある。幸いにも、Foregeneは私達持っている植物の総RNAの分離のキット、植物の総RNAの分離のキットのプラスを特別な植物のRNAの抽出のキットを提供できる。後者は高い多糖類およびポリフェノールの内容が付いている植物のために特に設計されている。RNAの抽出のために、実験室のユーザーからのフィードバックは特によい。

12. 凍結するサンプルを凍らせ、分解するサンプルの効果はより大きいかもしれRNAの抽出のために使用される前に切られる必要がある。サンプルは切断の間に（多分部分的に）溶けがちである。凍らせていたサンプルはRNAの抽出の前に重量を量られる必要がある場合もあり分解はこのプロセスの間に完全に起こる。時々、サンプルの分解はまた液体窒素製粉プロセスの間に起こる;または凍結するサンプルは製粉する液体窒素なしでlysateに直接加えられ分解は完全な均質化の前に完全に起こる。実験は凍結するティッシュが新しいティッシュより分解の間にRNAの低下に傾向があることを示した。本当らしい理由:freeze-thawプロセスは内生酵素がRNAが付いている直接接触に入って来ることができるようにそれをもっと簡単にする細胞内の構造を破壊する。

13. 通常RNAの質の判断が、電気泳動RNAの完全性を判断するのに使用されRNAの純度を判断するのにA260/A280が使用されている。理論では、そのままなRNAに28Sの比率がある:18S = 2.7:1は、およびほとんどのデータ28Sの比率を強調する:18S = 2:1。事実は細胞以外サンプルから得られる2:1の比率にRNAのほとんどどれもないことである（これはAgilent Bioanalyzerを使用して得られた）。

RNAの電気泳動の結果はEBによる飽和の二次構造、電気泳動の状態、サンプル負荷、ある程度、等を含む多くの要因によって、影響される。RNAを検出し、制御としてDNAのマーカーを使用するのに原産の電気泳動を使用しなさい。0.9kbの2kbそして18Sの28Sが明確、および28Sなら:18Sは> 1、完全性ほとんどのそれに続く実験の条件を満たすことができる。

A260/A280は多くの混乱を引き起こした表示器である。まず、核酸のためのこの表示器の本来の意味を明白にすることは必要である:純粋なRNA A260/280 =約2.0。純粋なRNAはbecauseであり、A260/A280は= 2 『効果』である。今度は皆はそれを「考えるbecauseとしてA260/A280をA260/A280なら= 2使用している、そして混乱を自然にもたらすRNAは純粋」である。

興味があれば、あなたのRNAのサンプルに、抽出で頻繁に使用され、フェノール、グアニジンのイソチオシアネート、止め釘、等のようなA260/A280比率を測定する小さい試薬を加えることができる。現実はRNAの抽出に、またサンプルで多くの不純物がA260/A280に影響を与えるA260およびA280のまわりで使用する試薬の多数吸収することである。

最も啓発的なアプローチは現在200-300 nmの範囲のRNAのサンプルをスキャンすることである。純粋なRNAのカーブに次の特徴がある:カーブは滑らか、A230でありA260は2つの屈曲ポイント、A300 0、A260/A280 =およそ2.0、およびA260/A230に近い=およそ2.0である。スキャン データが利用できなければ、A260/A230比率はまたこの比率が酵素の反作用に影響を与えるすべての不純物の持ち越しにより敏感であるので断固としたでなければならない。装置（A260のための0.1-0.5）の線形範囲を考慮に入れなさい。

2つの他の有用な現象がある:比率はA260/A280が水で測定される場合より低い約0.3である;比率が10のmMのエチレンジアミン四酢酸で測定する間、1つのmMのエチレンジアミン四酢酸で測定されるそれより高い約0.2はある。