RT-QPCR EasyTM Taqman 1つのステップ実時間RT-PCRマスターの組合せ

RTqPCR EasyTM （1つのステップ） - Taqman

cDNAを使用して実時間PCRのために、DNAを浄化した

製品紹介

Foregeneワン・ステップRT-PCR容易なシリーズ プロダクトは従って簡単だった実験ステップが実験計画最大限に活用し、実験効率が改良したことをRNAからのdouble-stranded DNAへの統合された反作用、すなわち、トランスクリプションを逆転させるためにおよびPCRの拡大が同じ反作用の遠心分離機管および同じ反作用システムで完了することを実現する。

RTqPCR EasyTM （1つのステップ） - Foregene HotStar TaqのDNAポリメラーゼを使用してTaqman、最大限に活用されたTaqmanのqPCRシステムすぐにそしてとりわけ跡のRNAの型板の実時間RTqPCR量的な検出を行うことができる。

輸送および貯蔵条件

• 交通機関の状態:全プロセスは低温冷蔵庫でキットが状態にのあることを保障するために運ばれる <4>
• 貯蔵条件:キットは-20℃で貯えられる。レシートの直後の-20℃で一定した温度冷却装置でプロダクトを貯えなさい。貯蔵条件が適切なら、プロダクトは1年の妥当性の期間の間に性能を低下させない。

キットの構成情報

• 2× RTqPCR EasyTMの組合せTaqman:Foregeneの逆TranscriptaseのRNaseの抑制剤、Foregene HotStar TaqのDNAポリメラーゼ、dNTPs、Mg2+、安定装置、増強物およびオプティマイザの最大限に活用された比率。
• ROXの参照の染料:通常PCRのサンプル ロード エラーによって引き起こされるPCRの管間の相違を調節するのにABI、Stratagene、等のような会社の実時間PCRの熱cyclersで使用されて。異なった器械によって必要なROXの参照の染料の集中は異なって、ユーザーは器械の推薦された集中に従ってそれを加えることができる。

注意:

uの試薬は繰り返された凍り、分解を避けるべきである他では試薬の性能は無効に減るか、またはなる。

uはライトからキットの試薬保護され、-20°C.で貯えられるべきである。

u貯えられる-80°Cで新しいサンプル抽出か型板のRNAを使用することを推薦する（RNAは繰り返された凍り、分解を避けるべきである）。

uはRNaseなしのスペースでRNaseの汚染を避けるために、実験を行う;ピペットの先端および使用されるPCRの管はRNaseなしでなければならない;そして使い捨て可能な手袋およびマスクを身に着けなさい。

uは実験のために特定のプライマーによってこのキット使用されなければならない。遺伝子が実験の必要性に従って増幅されることができるように特定のプライマーを選びなさい。

使用の前のuは溶解、軽打に氷に、2× RTqPCR EasyTMの組合せTaqmanを完全に置き、組合せはよりかなり前に使用する;システムの準備は氷浴でキットの性能を改善し、PCRの拡大を高めるために作動するべきである。

型板のRNAの集中

RTqPCR EasyTM （1つのステップ） - Taqman:（1ページ100 NGの合計のRNA）/20のμlシステム。

操作ガイド

:材料および試薬の準備

• 準備されたRNAの型板（RNAを得、浄化するのにForegeneの合計のRNAの分離のキット シリーズ キットを使用することを推薦する）、特定のプライマー（10 μM）および関連消耗品および器械準備しなさい。

注:RNAの完全性を保障し、新しいサンプルから得られるRNAを使用するために試みなさい。

• 自然に溶け、使用まで混合するために管の壁を打つようにそれがする氷の置かれた2× RTqPCR EasyTMの組合せTaqman、RNaseなしのddH2Oおよび20× ROXの参照の染料（必要ならば）。

B:RTqPCRシステム準備

2× RTqPCR EasyTMの組合せTaqmanは使用してが便利、速くすばらしい範囲に反作用システムの多数の準備によって引き起こされる操作および実験間違いの間に汚染を避ける。、反作用システムの容積半分だけ（反作用システムが20 μlなら、例えば使用するとき10 μl 2× RTqPCR EasyTMの組合せTaqmanの解決を取りなさい）、RNAの型板および特定のプライマーの適切な量を加え、容積の上で作るためにRNaseなしのddH2Oを加える。特定のRTqPCR反作用システム準備は1を次台に置くために参照できる。

表1:RTqPCRシステム準備

注:前方プライマーおよび逆のプライマーはターゲット遺伝子のための特定のプライマーである。qPCRシステムは実験必要性およびPCRモデルに従って調節することができる。ほとんどのプライマーの最終的な集中のために、私達は400nMを推薦する。私達の推薦された最終的な集中に従って準備された集中に従って特定のプライマーおよび調査の適量を調節しなさい。50μlシステムが付いているqPCRのために、試薬の量を比例して調節するために20μlシステムを参照しなさい。

1*:異なった量的なPCRの器械に従ってROXの参照の染料の適切で最終的な集中を選びなさい。共通の量的なPCR機械のためのROXの参照の染料の最適の集中は次のテーブルで示されている:

C:RTqPCR反作用システム設定

• 上のテーブルについてのRTqPCRシステムを、組合せ穏やかに準備した後（にピペット ピペットの先端を穏やかに使用できる;また管の壁か管の帽子で、および場所後で使用できるように分散する液体を集める冷蔵庫のvortexerおよび遠心分離機で簡潔に混合できる）。
• RTqPCR反作用プログラム設定（反作用の温度そして時間を置く表2）を参照しなさい。

注:2× RTqPCR EasyTMの組合せTaqmanの活動を保障し、拡大の効率を改善するために、PCRの器械プログラムをセットアップした後RTqPCR反作用システムを準備することが最善であるシステム準備が完了する直後に反作用プログラムが入れることができるように。

• 最もよいqPCRの効果を得るためには、勾配PCRが異なった型板および異なったプライマーのための反作用の条件を最大限に活用するのに使用することができる。

注:Foregene Hotstar TaqのDNAポリメラーゼの延長温度較差はこのキットで次のとおりである提供した:60-72℃および最もよい延長温度は72℃である。

次はRTqPCR反作用の状態の例である。PCRの反作用のためにツー ステップ方法を使用することを推薦する。型板の集中により無指定の拡大を引き起こすには余りにも低いとき低いプライマーTmの価値は低い拡大の効率をもたらすまたは悪い拡大のカーブの反復性、等のPCRの反作用のためのスリー ステップ方法を試みることを推薦する。表2-1 （ツー ステップ方法）およびRTqPCR反作用の状態の設定のための表2-2 （スリー ステップ方法）を参照しなさい。

表2-1:RTqPCR反作用プログラム配置（ツー ステップ方法）

表2-2:RTqPCR反作用プログラム配置（スリー ステップ方法）

1*:逆のトランスクリプション時間は実験必要性に従って調節することができる。βアクチンのような一般的な内生遺伝子は10分だけを必要とする;特定の表現された遺伝子を検出するため、逆のトランスクリプション時間は必要とされるに応じて適切に延長である場合もある。

2*:増幅されたターゲット片の長さに従って特定時を置きなさい。Foregene HotStar TaqのDNAポリメラーゼの拡大の速度は2kb/minである

注:PCRの反作用の状態は型板、プライマー、等の構造条件によって変わる。複雑な二次構造が付いているRNAの型板のために、逆のトランスクリプションの第一歩のために42℃を使用することを推薦する。特定の操作では、ターゲット片のサイズのような特定の条件に従って最適の反作用の状態を、増幅された片の基礎順序および焼きなましの温度、延長時間、等を含むプライマーのGCの内容および長さ、設計することは必要である。

作業の流れ: